Tout commence en septembre 2012 avec Desmond Miles. Ce dernier se fait kidnapper par la mystérieuse entreprise Abstergo où des scientifiques travaillent sur le projet Animus. L'Animus est une machine capable de lire la mémoire des ancêtres des utilisateurs dans leur propre ADN.

Desmond Miles a été choisi pour le projet en raison de sa ressemblance avec son ancêtre Altair, un membre des Assassins durant la Troisième Croisade en Terre Sainte. La suite de l'histoire se déroule à Jérusalem en 1191 ap. J.-C.

Vous incarnez donc Altair, un Assassin qui vient d'être rétrogradé au grade d'initié suite à l'échec d'une de ces missions. Son principal souci va donc être de retrouver son honneur et sa fiertée en accomplissant de nouvelles missions pour l'ordre des Assassins auquel il appartient.

Le voilà donc partit pour éliminer les principaux protagonistes du conflit qui règne actuellement en Terre Sainte. Il devra aussi bien s'en prendre aux Croisés qu’aux Sarrasins pour tenter d’enrailler la menace.

Cependant au fil des missions, Altair découvre que ses cibles sont liés par plus qu'un simple attrait pour le gain personnel, mais sont en fait tous des Templiers avec le but d'unir l'espèce humaine par un but commun, par n'importe quel moyen...